哺乳动物胚胎切割技术研究及应用进展

摘要：胚胎切割是研究细胞分化、早期胚胎发育、胚胎遗传性能的主要方法，也是早期胚胎性别鉴定的必要手段。文章介绍了胚胎分割技术研究进展，不同发育阶段胚胎分割方法，影响分割胚胎的成活效果因素以及胚胎分割技术的应用，以作参考。

胚胎切割是哺乳动物胚胎工程的重要组成内容，是应用显微手术的方法，将一枚胚胎分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或者体外培养，然后移植入受体中，获得同卵双生或同卵多生后代的技术。胚胎分割是扩大胚胎数量的有效方法，也是胚胎克隆技术的一种，其不仅增加了优秀个体数量，而且还可将同卵双生后代用于各种试验研究，能排除遗传特性差异所带来的影响，在科学研究和畜牧生产中具有重要的意义。

1哺乳动物胚胎切割技术的研究进展

　1901年Spemann首次将蛙的两个卵裂球分离开，人工产生了双胞胎。1970年Mullen等将小鼠2-细胞胚胎的两个卵裂球分开，经过体外培养后再移植给受体，产生了哺乳动物的首次人工双胞胎。1978　Moustafa等将小鼠桑椹胚一分为二，得到双胞胎。1979年Willadsen[1]和Meineck-Tillmann等分别将绵羊2-细胞胚胎和桑椹胚一分为二，获得同卵双胞胚。80年代以来，哺乳动物胚胎分割技术飞速发展。Willadsen[2]等在总结前人的基础上，对胚胎分割进行了系统的研究，创造出了毛细管分离法，并先后分离2、4、8细胞绵羊胚胎，获得后代羔羊。毛细管分离法虽然具有较高的同卵多生的优点，但需要琼脂包埋和中间体的体内培养，很难做到与受体同期化，且操作复杂。1982年，Ozil等[3]把分割后的牛的半胚分别装入空透明带内，移植获得同卵后代。后来，Gatica等（1984）简化的操作方法，将细胞团从切开的透明带中取出，用玻璃针一分为二，再将半胚分别移入空透明带中直接移植，获得了7只双胎。1984年，Williams等[4]用显微手术刀分割牛桑椹胚和早期囊胚，获得9头双胎犊牛。

后来，胚胎切割和性别鉴定技术结合起来，以及嵌合体的应用，为胚胎切割技术扩大了应用和推广的范围。

我国胚胎切割技术的发展与应用20世纪80年代发展迅速。1988年，谭丽玲[5]等分割兔半胚产仔，1989年张涌等[6]山羊冻胚分割产羔，90年代前后分割牛羊成功，郭志勤等于1989年获得奶牛冻胚分割植后产同卵双犊和1992年绵羊鲜胚分割四分胚移植产同卵羔[7-8]；1989年牛四分胚成功产犊。

通过胚胎分割技术还可获得性别和遗传上完全相同的同卵孪生或多生后代，为遗传学、生理学、营养学等研究提供宝贵试验材料。目前二分胚成功的有小鼠、兔、绵羊、山羊、牛、马和人。四分胚成功的有兔、绵羊、猪、牛、马，八分胚成功的有兔、绵羊、猪。

2.胚胎切割方法

2..1微细管吹吸法

借助显微操作仪，在D-PBS培养液中，左手持固定吸管吸住胚胎，右手操作玻璃微针切开胚胎透明带，细胞团即从透明带中脱出，用毛细管吹吸胚胎，得到单个卵裂球，再将其装入空透明带中，体外培养至桑椹胚或囊胚期，移植入同类受体中。此方法适于分离二细胞期到八细胞期卵裂球。

2..2显微手术法

在显微操作仪的帮助下，在D-PBS液内，用固定吸管吸住胚胎，用玻璃针或显微手术刀将胚胎对称切割。这种方法适于分割桑椹胚和囊胚期胚胎。

2..3徒手分割法

在立体显微镜下，徒手握住特制切割刀，在皿底部轻轻划痕，然后将胚胎轻轻推入划痕处，通过增大摩擦力来固定住胚胎，将刀片自上而下垂直切割胚胎，操作过程要快，一刀切开。这种方法多用于切割桑椹胚和囊胚。

3影响切割胚成活效果的因素

3.1胚胎发育时期

不同发育时期的胚胎分割后，其发育能力是有差异的。1984年，Williams　等[4]用显微手术刀分割5.5~7.5日龄牛胚胎，晚期桑椹胚、早期囊胚和囊胚的半胚移植妊娠率分别为47.5%、60.4%和53.6%。1989年，张涌等[6]分别利用不同发育时期的羊半胚切割移植，结果晚期桑椹胚、囊胚、孵出囊胚和孵出增大胚泡各组半胚生产羔羊的成功率分别为12.5%、20%、25%、62.5%。1995年，马宝华[8]报道，安哥拉山羊早期囊胚、囊胚和扩张囊胚的半胚移植后成羔率分别为28.6%、33.3%和9.5%。由以上报道可以看出囊胚半胚的成犊率高于来自于桑椹胚的半胚。

3.2胚胎切割次数

四分胚的成活力、妊娠率、双胎率都远低于二分胚。1992年窦忠英[9]等将18枚7日龄奶牛胚胎一分为四分割的半胚移植给受体，只有9头受孕　，受孕率为50％。Rho等[10]　(1998　)发现四分牛的桑椹胚和囊胚只得到一个四分胚后代。

3.3透明带的完整性

透明带可以阻止微生物和病毒进入胚胎内部，对胚胎具有一定的保护作用。但桑椹胚和囊胚时期，半胚有无透明带对妊娠率没有太大影响。1995年，马保华等[8]用链霉蛋白酶液软化透明带后分割胚胎，试验结果发现可降低半胚存活率。Sotomaru等[11]曾发现，有透明带的分割胚比无透明带的分割胚对冻融有更高的抵抗力。2000年赖双英[12]等用酶分离小白鼠早期胚胎，获得的卵裂球没有透明带也能够继续发育。张涌等[6](1989)对称分割山羊孵出增大胚泡，不装透明带移植其裸半胚，仍可继续发育形成正常胎儿，而且获得较高的同卵双生率。

3.4植入半胚的数量

许多学者研究表明，移植1枚半胚妊娠率低于同时移植2枚半胚的妊娠率。Lambeth　等　(1983)对半牛胚移植研究表明，同等条件下，移植1枚或2枚半胚于受体牛的黄体侧子宫角后，妊娠率分别为　16.7％(1／6)　和62.5％(　5／8)，而且后者获3对同卵双生。Maurer等　(1988)将2枚绵羊半胚移植于受体羊黄体侧或双侧子宫角各1枚时，妊娠率分别为57.1％和20.0％。马保华等[8](1995)　的实验也同样证明将2枚裸半胚同时移植于受体羊黄体侧子宫角后，获得了较好的结果。

3.5半胚在体外停留时间

Bader(1985)研究证明鲜胚分割后用血清PBS液培养4h以上后妊娠率降低。陶涛等[13]　(1991)　对奶牛胚胎分割实验发现　，半胚在体外滞留时间超过4　h和受体的黄体发育不佳均显著降低半胚的受胎率。DearmasR(1986)报道在20%　FCS-　PBS液中培养2h的半胚，其存活力最高。可见，半胚在体外停留时间对半胚成活力的影响较大，超过4个小时后存活力会大大降低。

4胚胎切割技术的应用

4.1胚细胞核移植

胚胎切割可为基因治疗和基因活性的研究提供有利的动物模型。早期胚胎细胞是一群遗传上同质的细胞，以胚胎细胞作为核供体，进行动物核移植，可为各项研究提供大量材料。Meng[14]　等（1997）将猕猴的单个卵裂球进行卵母细胞注射，经过体外培养和移植后，生出一对不同性别的两个后代。1998年，Le[15]等分离牛的单个卵裂球作为核供体，生出克隆牛。

4.2构建异胚重构体

将供体的细胞核，移植到处于第二次减数分裂中期的去核卵母细胞中，在卵母细胞相关因子的作用下，细胞核发生重编程恢复到发育的起点状态，重构胚具有重新发育成新个体的能力。制作重构胚并将其移植到受体中，让其生长发育成为新的动物，这也是制备转基因动物的方法。

4.3生产嵌合体

应用显微操作技术，将同种或异种胚胎的卵裂球分离出来，装入同一个透明带内，将两个半胚融合在一起，经体外培养后移植入受体中，嵌合体动物对于研究种间妊娠中母胎之间的相互作用和母体的免疫识别有重要意义。

4.4胚胎性别鉴定

在胚胎移植前将胚胎切割约十分之一，然后将取下的部分通过染色体分析、H-Y抗原抗体免疫学和PCR技术进行性别鉴定，在胚胎早期即可得知胚胎性别，进而生产出已知性别的动物，在动物的性别需要育种中意义重大。

4.5生产同卵双生后代

在牛上不仅可以移植半胚生产同卵双胎，增加后代数量，而且可避免异性双胎不孕现象的发生。清家升[16]（1991）报道，每头受体牛移植两枚半胚和一枚半胚的胚胎着床率分别53.8%和48.4%，同时移植两枚半胚的双犊率为15.4%，而分别移植半的同卵双犊率为45.2%。

4.6保存珍稀家畜动物的种质资源

胚胎分割技术可以增加优秀种畜、濒危珍稀动物以及有价值的转基因动物的数量，并且根据需要可长期保存这些动物的物种。

5小结

胚胎切割技术可使胚胎数量成倍地增长，获得到同卵双生后代，在试验研究和濒危动物的保种中具有重要的应用价值。但胚胎分割技术也存在半胚移植后的妊娠率和产仔率不高，后代体质弱、体重低等问题，这需要研究者从胚胎分割方法、分割胚的有效培养、保存方法等方面进一步研究，提高分割胚的妊娠率，同时随着生物技术的不断发展，胚胎分割技术的应用价值也会有更广阔的应用前景。

参考文献：

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