布鲁氏杆菌病的检验方法

赵玉康 罗鹏飞 （新疆阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心 836500）

布鲁氏杆菌是革兰氏阴性细胞内寄生菌，容易引起动物和人类的慢性感染或急性感染，被感染的动物会表现出不孕不育或流产等症状，危害很大。布鲁氏杆菌病一年四季都有可能发生，其发病率因各个地区的饲养条件和繁殖习惯以及经济条件、气候条件、自然条件的不同而不同。所以对其进行及时并准确的检验非常重要。现将检验方法和操作步骤介绍如下。

1 平板凝集试验

试验目的是利用本试验对大量样本进行初步筛选。筛选出的阳性反应血清，再做试管凝集试验，以试管凝集的结果作为被检血清的最终结果。

取一长方形洁净玻璃板，用玻璃铅笔划成若干方格，每格约4平方厘米，编号。分别吸取25微升被检血清、生理盐水、标准阳性血清、标准阴性血清加于不同编号的方格内，每吸一种成分需换一个吸头。吸取25微升抗原加到玻璃板的每一个格内，用牙签将抗原与血清充分混匀，每混匀一格需更换一根牙签。于室温（15℃以上）静置4分钟观察结果，如室温过低，可适当加温。在对照标准阳性血清（+）、标准阴性血清（-）、生理盐水（-）反应正常的前提下，被检血清出现大的凝集片或小的颗粒状物、液体透明判为阳性（+），液体均匀混浊，无任何凝集物判为阴性（-）。

2 试管凝集试验

试管凝集试验是一种定量试验，可排除玻片法凝集试验的非特异凝集，是鉴定细菌更为准确可靠的凝集试验，用以检测待检血清中是否存在相应抗体和测定该抗体的含量，以协助临床诊断或供流行病学调查。

每份血清用4支试管（1×8厘米），另取对照管3支。如待检血清多时，只设一份对照组。用0.5%石炭酸生理盐水，将被检血清稀释成四个稀释度。第五管中不加血清，设抗原对照。第六管中加1∶25稀释的布鲁氏杆菌阳性血清0.5毫升作阳性对照。第七管中加1∶25稀释的布鲁氏杆菌阴性血清0.5毫升作阴性对照。各管中加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释20倍的布鲁氏杆菌抗原0.5毫升（每毫升含菌8亿）。

各试管加完抗原后，充分振荡，置于37℃温箱中4~10小时，取出置于室温18~24小时，然后观察并记录结果。待检血清稀释度，猪、羊、犬为1∶25、1∶50、1∶100和1∶200，牛、马和骆驼为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400这4个稀释度。大规模检疫可只用两个稀释度，即猪、羊、犬为1∶25和1∶50，牛、马和骆驼为1∶50和1∶100。

结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。“++++”，液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状，表示菌体100%被凝集。“+++”，液体稍有混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况同上，表示菌体75%被凝集。“++”，液体不甚透明，呈淡乳白色混浊，管底有明显的凝集沉淀，振荡时有块状或小片絮状物，表示菌体50%被凝集。“+”，液体透明度不明显或不透明，管底有不甚显著的沉淀或仅有沉淀的痕迹，表示菌体25%被凝集。“-”，液体完全混浊，不透明，有时管底中央有一部分圆点状沉淀物，但振荡后立即散开呈均匀混浊，表示菌体完全不凝集。确定血清凝集价（滴度）时，应以出现“++”以上凝集现象的最高稀释度为准。

判定标准。牛、马和骆驼凝集价为1∶100以上（www.nczfj.com），猪、羊和犬的凝集价为1∶50均判为阳性。牛、马和骆驼凝集价为1∶50，猪、羊和犬凝集价为1∶25均判为可疑。可疑反应的家畜，经3~4星期后再采血重新检查。牛和羊仍为可疑判为阳性，猪和马仍为可疑，而畜群中又没有病例和大批阳性病畜，则判为阴性。

3 虎红平板凝集试验

在清洁的玻片上加0.03毫升的被检血清，然后再加入虎红平板凝集抗原0.03毫升，充分混合均匀，4分钟内观察结果。以出现可见的凝集现象判定阳性，无凝集现象为阴性，无可疑反应。

4 注意事项

待检血清必须新鲜，无溶血现象和腐败。稀释血清时，要反复吹吸几次、完全混匀才能移入另一管，而且注意不要在吹吸时产生气泡。每次需做阳性血清、阴性血清和抗原三种对照，在结果判定时，要先检查对照管，只有对照管均正确时才能检查判定试验管。