昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其在疫苗中的应用

梁璐琪

（四川省动物疫病预防控制中心，四川成都610041）

摘要　昆虫杆状病毒载体表达系统作为四大表达系统之一，已广泛应用于重组蛋白的合成。综述了该病毒的基本特性、杆状病毒表达载体系统、该系统表达的病毒疫苗等应用前景。

杆状病毒是已知的昆虫病毒中最大的类群，是发现最早，应用广泛的昆虫病毒。自20世纪80年代杆状病毒表达载体系统(Baculovirus　expression　vector　system,　BEVS)建立以来，已经被应用于农业生产，医疗卫生等领域，成为除大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统外的第四大基因工程表达系统。昆虫杆状病毒表达系统具有安全性高、基因克隆容量大、具有完备的翻译后加工修饰系统、高效表达外源基因、无内毒素污染等优点。

1杆状病毒的基本特性

杆状病毒粒子由杆状核衣壳和包被其的二层脂蛋白囊膜组成，而核衣壳则是由衣壳蛋白和由病毒DNA分子与碱性蛋白构成的髓核组成。杆状病毒感染宿主细胞可以产生包涵型病毒，又称多角体获得型病毒和芽生型病毒，又称胞外病毒两种类型的病毒。在感染过程中，部分核衣壳外形成囊膜，多角体或颗粒蛋白沉积于宿主细胞细胞核的囊膜上，形成包涵体病毒。另一部分核衣壳则通过出芽的方式从宿主细胞的细胞质膜获得囊膜，形成芽生型病毒。包涵体型病毒主要进行个体间传播，而芽生型病毒主要负责体内病毒的传播[1]。

杆状病毒的基因组是大约120kb的双链DNA分子，约含80个非重叠基因，可分为结构蛋白基因和非结构蛋白基因两大类。编码结构蛋白基因为30个，明显低于基因组DNA编码的蛋白数，表明基因组内含有编码具有调节酶活性的蛋白的基因[2]。同时病毒DNA同碱性蛋白紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构，并增强杆状病毒DNA的感染性。

2杆状病毒表达载体系统

杆状病毒表达载体系统是20世纪80年代早起由Smith等[3]和Maeda等[4]建立的。同其它的表达系统相比具有以下的优越性。（1）.安全性：杆状病毒具有高度的种属差异性，不感染脊椎动物，相对于痘病毒等载体而言安全性要好。（2）.杆状病毒基因组较大，具有多个天然启动子，可以实现多基因表达，因此可以插入多个外源基因，利于形成病毒样颗粒。（3）.表达效率高：杆状病毒表达载体系统可以高效的表达外源基因，表达量最高可达感染细胞总蛋白另的50%。（4）.具有完备的翻译后加工修饰系统：昆虫细胞对蛋白表达后修饰加工方式同哺乳动物相似，使得表达产物具有很好的生物学活性。正由于以上的优势使得该表达系统从建立以来就获得广泛的关注和研究，并对其进行不断的优化和改进。

杆状病毒载体系统主要分为两大类：一类是用于表达单个外源基因的载体；另一类是多元表达载体[5]。最常用的是在多角体蛋白启动子下游含有单一克隆位点的接头插入不同外源基因，如pBacPAK8/9和pBacШ系列。而一些转移载体如pBlueBac　His系列载体适于表达融合蛋白，产物可以同和亲和层析得到纯化。除二元表达载体外，三元四元表达载体也已经建立。此外根据不同的使用要求，以及对重组蛋白表达的需求，使用异源先导序列或信号肽改进的载体，或用病毒早期启动子、晚期启动子、非杆状病毒启动子构建的转移载体均有报道[6]。

杆状病毒载体系统最大的改进之一是通过亲本病毒的线性化大大提高重组病毒筛选效率。如Possee　等设计的重组-救活可线性化AcNPV　病毒载体　BacPAK6　的重组效率较高,　高达80%　以上,　具有重要的应用价值[7]。

杆状病毒载体系统另一关键性的改进是杆状病毒穿梭载体bacmid的构建[8]。使得杆状病毒基因可以修饰并使其在大肠杆菌内像质粒那样复制，如Invitrogen公司的Bac-to-Bac系列。

3杆状病毒载体系统表达的病毒疫苗

3.1人乳头瘤病毒（HPV）疫苗

HPV主要引起皮肤、黏膜的良性或恶性肿瘤如宫颈癌。HPV基因组的早期区部分编码的E6、E7蛋白为癌蛋白；晚期区编码的衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2,是引起人体免疫反应的主要蛋白。

1994年，利用杆状病毒表达系统表达出L1、L2蛋白，并组装成病毒样颗粒蛋白（VLP），具有典型的HPV结构基础。通过实验发现，VLP可以与单克隆抗体发生反应。经免动物后，发现该VLP可以激发免疫的动物的体液免疫系统及细胞免疫[9]。此外，研究发现该VLP还可以作为多重抗原表位的载体，产生佐剂的效用[10]。

3.2艾滋病病毒疫苗[11]　

人类免疫缺陷病毒（HIV）是引发艾滋病的病原体，目前发现其有HIV1和HIV2两种亚型。利用杆状病毒载体表达系统构建获得的无传染性的VLP通过实验发现其可诱导细胞免疫和中和抗体免疫反应。而在小鼠黏膜免疫实验中发现既有黏膜免疫反应，又有系统免疫反应。该疫苗已经于20世纪80年代进入临床实验，但最终因该疾病的特殊性，所以未能走入市场大范围使用，但仍未艾滋病疫苗的研制提供一种新思路。

3.3动物疫苗

目前使用杆状病毒载体表达系统研制出的具有免疫效力的亚单位疫苗如禽流感病毒、牛疱疹病毒、犬细小病毒、蓝舌病毒、口蹄疫病毒、圆环病毒疫苗等。除圆环病毒疫苗外，大多数疫苗仅限于实验室疫苗，未能应用于市场。2006年勃林格殷格翰公司在国外市场首次推出猪圆环2型病毒疫苗，并很快占领该疫苗超过60%的市场份额。2010年该疫苗引入国内，成为国内兽用疫苗市场上首个针对猪圆环病毒的疫苗。通过长期的使用和实践证明该疫苗具有较好的保护力，应激反应小，为目前圆环疫苗市场的主力产品。利用杆状病毒载体系统表达的禽流感病毒H5型和H7型的HA[12]，牛副流感病毒3型蛋白都具有良好的抗体中和反应[13]。

4细菌疫苗

与病毒疫苗相比，针对细菌感染的亚单位疫苗的报道较少，至今未能有成功的重组细菌疫苗供人类使用。而使用杆状病毒载体系统表达的细菌疫苗更少，目前仅见到有使用杆状病毒载体系统表达布鲁氏杆菌热激蛋白的报道[14]。

5寄生虫疫苗

寄生虫的结构较病毒要复杂的多，同时在人体或哺乳动物体内经历不同的发育生长阶段，具有不同的生长状态和模式，会出现免疫逃避的现象，种种因素导致寄生虫疫苗的研究和发展。近年来，通过使用多基因疫苗免疫策略突破了寄生虫免疫的障碍[15]。利用杆状病毒载体表达系统对恶性疟原虫、血吸虫等寄生虫进行重组蛋白、抗体方面的研究[16]。

杆状病毒载体表达系统的表达效率高、表达蛋白的加工修饰过程及安全性好等优势使该系统自建立以来就被广泛的关注和研究并大量的应用于农业生产和医疗卫生领域。随着对该系统的不断的深入研究，改进和完善，其在疫苗研制领域必会产生越来越重要的作用，从而为人类健康和动物健康提供越来越多的帮助和保护。

参考文献

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[15]　李柳哲,　石佑恩.　降低血吸虫病传播的钉螺控制策略.国外医学寄生虫病分册,1999（02）　:49-51.

[16]　孙文宇，　刘述先.杆状病毒表达载体的构建及其在疫苗研究中的应用　.　国外医学寄生虫病分册,1999　（03）:97-100.

我国玉米进口量或进一步增加

近几年，我国玉米进口量节节攀升，自2010年起呈现出爆发式增长，从2009年的8.3万吨一下跳跃到157.2万吨，同比增长近18倍。2012年再创新高，达到了520.64万吨。?业内人士认为，我国玉米进口量逐年递增的原因有三。首先，其主要原因是国内对玉米消费的不断增加。经过十几年的发展，2013年度国内玉米消费量达到了1.9亿吨，消费量增加了53%，2013年我国的玉米产量为2.1亿吨，若除去消费量，玉米库存仅剩0.2亿吨。而玉米作为我国的第三大粮食作物，在粮食生产中的地位举足轻重且关系到我国的粮食安全问题，因此要保留丰富的库存和满足国内的消费就需要依赖进口。其次，我国玉米产量增长放缓，国内消费缺口增大。玉米产量经过了数十年的飞速发展，近两年增长脚步放缓；此外中国城镇化进程的发展，建筑、道路等大量侵吞耕地面积，导致玉米耕中面积减少。第三，今年河南，辽宁等主产区遭遇严重干旱，东北玉米或将小幅减产。再次，进口玉米质优且价格便宜。由于政府收储抬高玉米价格,今年玉米收购价格在2300~2400元/吨，2012、2013年玉米进口年均价为323美元/吨，折合人民币为1989元/吨、比国内玉米便宜近400元/吨。近两年由于转基因玉米的问题，我国数次拒收进口美国的转基因玉米，进口玉米数量有所放缓，但业内人士分析认为:若政府放开对转基因玉米的限制，我国玉米进口量将会进一步增加。