一株鸭病毒性肝炎的分离和鉴定

张广才

（山东省博兴畜牧兽医局，山东滨州256500）

鸭病毒性肝炎主要感染1周龄内雏鸭，以发病急、传播快、病程短、发病率和死亡率高为主要特征，每年都给养鸭业带来了巨大的经济损失，严重危害着养鸭业的健康发展。在我国，该病的致病原主要是鸭甲肝病毒中的基因A型和C型。现对山东博兴1例疑似感染鸭病毒性肝炎的病例进行了临床诊断，并采集病死鸭的肝脏等组织进行了病毒的分离与鉴定，为发病鸭场找到了致病原因，也为基因A型鸭甲肝病毒新型疫苗、诊断试剂、卵黄抗体的研制奠定了基础。

1材料与方法

病料样品来源：病料样品采自山东博兴某发病鸭场病死鸭的肝脏组织。主要试剂盒：病毒基因组RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。临床诊断：观察发病鸭场鸭的临床症状和病理变化。病毒分离：无菌取死亡鸭的肝脏组织与灭菌生理盐水以1：3比例混合，研磨成组织匀浆，反复冻融3次，12000r/min离心10Min，上清液经0.45um滤膜过滤除菌，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.2mL/胚，弃去24h内死亡胚，死胚随时取出放4℃保存，120h后，收获全部死胚尿囊液，连续传3代，-　20℃保存。分离毒株的血凝性测定：按常规方法测定第3代分离毒株的尿囊液对1%鸡红细胞的凝集性。分离毒ELDs。测定：用灭菌生理盐水将第3代分离毒的尿囊液做10倍系列稀释，取10-4、10-5　,10-63个稀释度分别接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接5枚，0.1　mU胚，按Reed　-Muench法测定分离毒株的ELD。

致病性试验：取第3代分离毒的尿囊液按100　ELD的接种剂量接种7日龄健康雏鸭10只，接种方法为颈部皮下注射，接种剂量为0.2　mL/只，取10只雏鸭接种灭菌生理盐水作为对照。2组试验鸭均隔离饲养，观察14天，观察记录试验鸭的发病、死亡情况，对死亡雏鸭剖检，观察病理变化。

RT-PCR检测：根据参考文献分别设计合成检测鸭病毒性肝炎病毒I型和新型特异性检测引物，利用病毒基因组RNA提取试剂盒提取第3代分离毒株尿囊液的病毒基因组RNA．以提取的RNA为模板，参照参考文献的方法进行鸭病毒性肝炎病毒I型和新型的RT　-　PCR检测。

2.结果与分析

临床诊断结果：病鸭表现精神沉郁，采食减少或不食，喜卧，发病2~3天后出现死亡，死亡雏鸭呈角弓反张。对病死鸭剖检可见肝表面有针尖大小出血点、肝脏极度肿大、质脆。病毒分离结果：临床病料接种SPF鸡胚后48~　72　h出现死亡，120　h后全部死亡，死亡鸡胚胚体全身出血，肝脏严重出血、有明显的坏死灶或坏死点。将无菌收集的第3代死亡鸭胚尿囊液-20℃保存备用。

血凝性测定结果：分离毒株对1%鸡红细胞无血凝性。E　LDso的测定结果：按Reed　-　Muench法测定第3代分离毒的E　LD50为10　-4.8310.1mL。致病性试验结果：试验鸭在攻毒后24h开始出现食欲废绝、精神萎靡、两脚痉挛等临床表现，至96h已死亡9只，致死率高达90%，死亡鸭呈现典型的角弓反张姿势。解剖病死鸭可见肝脏出血、肿大、具有出血斑等典型的病理变化。对照组10只雏鸭全部健康，食欲、精神状态均正常。分离毒株具有较强的致病性。RT　-　PCR检测结果：按照参考文献‘31的方法对第3代分离毒尿囊液进行RT-　PCR检测．RT　-　PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳可见大小为317　bp的扩增条带，与鸭病毒性肝炎I型的预期大小一致，即检测结果为鸭病毒性肝炎I型阳性。

3讨论

鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的重要病毒性传染病，该病主要感染雏鸭，发病率和死亡率都很高。本研究分离毒株的获得为鸭病毒性肝炎多价疫苗和多价高免卵黄抗体的制备奠定了基础。同时本研究显示，利用10日龄SPF鸡胚可以进行鸭病毒性肝炎病毒的分离，表明鸭病毒性肝炎地方流行株适应在SPF鸡胚中繁殖。各型病毒引起鸭病毒性肝炎的临床症状相似，给鸭病毒性肝炎的分型检测增加了难度，本研究也证实RT-PCR检测方法可以进行鸭病毒性肝炎的分型检测，可在分离毒株的分型鉴定和临床鉴别诊断中推广应用。