常州地区猪传染性胃肠炎和呼吸道冠状病毒病血清学调查

罗坚强 柴文娴 王姣 奚德华

常州市动物疫病预防控制中心，江苏常州213002

传染性胃肠炎(TGE)是一种高度传染性病毒性肠道疾病，其特征为引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率（通常100%）。20世纪80年代，能感染呼吸系统的TGE病毒基因缺失变异株，即猪呼吸道冠状病毒(PRCV)出现并广泛流行，由于两者存在共同的抗原位点，PRCV改变了TGEV临床传播和发病状况。TGEV和PRCV对各年龄段的猪都易感，但TGEV对超过5周龄的猪群死亡率很低，而PRCV -般呈亚临床感染。

由于TEGV和PRCV存在抗体交叉反应，猪体内的PRCV的感染抗体可中和TEGV病毒，同时也干扰了用血清学方法诊断和鉴别TGFV和PRCV感染”。对于TGEV和PRCV阴性的猪场，一旦发生TGEV，就会造成很大的损失；而对于PRCV阳性的猪场，则可能形成各年龄段猪TGEV温和型发病，掩盖了TGEV的感染。本调查使用TECV和PRCV抗体鉴别试剂盒，试图了解本地区生猪TECV和PRCV感染情况。

1 试验材料

1) 样品：采自养殖场、屠宰场猪血清共308份，其中规模养猪场（存栏≥500头）109份，散养户(存栏<500头)89份，养殖场采样群生猪日龄在60~90 d之间。屠宰场样品来自本市3个屠宰场的10批待宰猪，其中来源地为本市养殖场的50份，来源地为外省养殖场的的60份。

2)试剂：INGENASA TGEV和PRCV抗体鉴别ELISA试剂盒，购自某公司，批号：280113。

3)仪器设备：Bi0680酶标仪，Eppendorf移液器一套，Tecan洗板机等。

2 试验方法

对所有样品用ELISA方法检测TGEV和PRCV抗体。

2.1 操作过程

所有试剂和待检血清检测前恢复到室温(18~25℃)；25倍稀释洗涤液；每孔加样品稀释液50μL；A1、A2孔加PRCV阳性对照血清50 μL，Bl、B2孔加TGEV阳性对照血清50 μL，Cl、C2、Dl、D2孔加阴性对照血清50μL;待检样品每个样加并排两个孔，如第1个样为El、E2，第2个样为Fl、F2，依此类推；封板，37℃孵育1 h；洗板3次；将酶结合物A加到板上的奇数排，酶结合物B加到板上的偶数排；37℃孵育30 min；洗板6次；每孔加入100μL底物，暗室室温放置10 min；每孔加入100 μL终止液，5 min内酶标仪450 nm波长读数。

2.2 试验有效性判断

本试剂盒要求符合以下条件：TGEV阳性对照酶结合物A孔OD值<0.3，酶结合物B孔OD值<0.3；PRCV阳性对照酶结合物A孔OD值<0.3，酶结合物B孔OD值>0.7；阴性对照酶结合物A孔OD值>1.0，酶结合物B孔OD值>1.0。

2.3临界值(cut off)的计算

PRCV阴性，阳性临界值cut off(1)=0.6×阴性对照在酶结合物A孔的OD值；TGEV阳性临界值cut off(2)=0.6×PRCV阳性对照在酶结合物B孔的OD值；TGEV阴性临界值cut off(3)=0.6×PRCV阳性对照在酶结合物B孔的OD值。

2.4 结果判定

分2步：第1步，如果样品在酶结合物A孔的OD值高于cut off(l)，则该样品TGEV和PRCV均为阴性，其他样品进入第2步判定。第2步，如果样品在酶结合物B孔的OD值低于cut off(2)，则判定为TGEV阳性；高于cut off(3)，则判定为PRCV阳性；在cut off(2)和cut off(3)之间，则判为可疑样品。

3 结果

1)来自养殖场和屠宰场的共308份血清，经ELISA方法检测其TGEV和PRCV抗体，结果见表1。根据表1结果可知，共检出TGEV阳性样品9份，全部来自同一养殖场；检出PRCV抗体阳性样品86份，规模养殖场、散养户、屠宰场均有阳性样品检出。TGEV抗体阳性率为2.92%，PRCV抗体阳性率为27.92%。

2)TGEV和PRCV阳性场和批次统计见表2。由表2可知，没有检出仅TGEV阳性的场或批次；仅PRCV阳性的场和批次中，规模场比例最少( 1/8)，散养场其次(4/7)，屠宰场本地和外地猪均为50%；有1个规模养殖场同时感染TGEV和PRCV。

4 讨论

TGEV与PRCV抗原关系密切，产生的抗体存在交叉反应，常规的血清学检测方法难以鉴别。但PRCV的S蛋白存在1或2个抗原位点的缺失，所以，使用针对PRCV的S缺失区的抗原位点的单克隆抗体建立的阻断ELISA，可从血清学上区分PRCV和TGEV感染猪。本检测试剂盒中，酶结合物A含有两个病毒共同保守位点的酶标单抗，只要感染了任何一种病毒的猪血清都会阻断其与包被的病毒蛋白结合；而酶结合物B只含有针对TGEV特有位点的酶标单抗，只有含TGEV抗体的猪血清与其竞争，从而区分血清中包含的TGEV和PRCV抗体。该方法操作简便，广泛用于目前的TGEV和PRCV血清学检测。

本次调查中，TGEV血清阳性样品全部来自同一养殖场，其TGEV阳性率达到60%。经核实，该场每年冬春TGEV高发季节对仔猪进行TGEV疫苗免疫，本次采样群也进行了免疫，该场TGEV阳性与免疫有关；但PRCV抗体阳性率达33%，表明该场猪群存在PRCV感染。在PRCV阳性场进行TGEV疫苗免疫，是否会对TGEV血清转化和PRCV的感染率产生影响，需要进一步研究，但无论如何，TGEV疫苗抗体和PRCV感染抗体一起对TGEV形成了保护，虽然这种保护并不完全。

近年来，国内陆续开展了一些TGEV和PRCV血清学调查工作。蒋静等对上海、安徽等4省调查显示，猪TGEV抗体阳性率为6.8%，且都与免疫有关；PRCV抗体阳性率为18.7%。洪尼宁等调查显示，贵州省猪TGEV血清阳性率为0.41%，PRCV血清阳性率为1.51%。陈小丽等对福建省三明地区规模猪场的调查结果显示，猪TGEV血清学阳性率为19.8%，PRCV血清学阳性率为25.9%。以上3个地区的调查结果存在较大的差异，其原因需要进一步研究，而本次调查结果排除屠宰场数据后，与蒋静等的调查结果基本一致。

本次调查还显示，散养户生猪PRCV感染率是规模场的3倍，考虑到PRCV高传播性导致的阳性场的高感染率，可认为主要与散养户中阳性场比例高于规模场有关；而屠宰场（本地）样品的PRCV阳性率(28%)略高于养殖场(22.73%)，可能与屠宰场生猪生长期较长、累积的感染几率大有关。

PRCV在提供对TGEV感染的交叉保护的同时，还能作为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的病原之一，参与多因素呼吸道疾病的发生，造成经济损失，因此，各养殖场要根据实际情况，去弊存利，做好TGEV和PRCV的防控工作。

收稿日期：2014-08-20

罗坚强，男，1979年生，硕士，兽医师。