牛膝水煎液及甾酮类组分对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症因子的影响

牛膝为苋科牛膝属植物牛膝(Achyranthesbidentata　Blume)的干燥根，主产于河南，具有补肝肾，强筋骨，逐瘀通经，引血下行之功效，用于腰膝酸痛，筋骨无力，经闭癥瘕，肝阳眩晕等症[1]。牛膝是我国的传统中药，有着悠久的历史，其始载于《神农本草经》，列为上品，因形似牛膝而得此名，其主要含有甾酮类、皂苷类等化学成分。现代药理研究表明，牛膝具有兴奋子宫[2]、抗骨质疏松[3]、抗衰老[4]、增强免疫功能[5]、改善血液流变学[6]、治疗不孕症[7-8]等作用。小鼠巨噬细胞RAW264.7模型为目前广泛应用的炎症反应模型，现通过研究牛膝水煎液及甾酮类组分对脂多糖(LPS)诱导下RAW264.7细胞NO分泌量、TNF-α、IL-1β的影响，探讨牛膝水煎液及甾酮类组分的抗炎作用，为研究牛膝抗炎作用的物质基础及作用机制提供科学依据。

1、材料

1.1药材与试剂

牛膝药材(购自河北安国，经北京中医药大学大学张贵军教授鉴定为苋科牛膝属植物牛膝的干燥根)；D101大孔吸附树脂（上海源叶生物科技有限公司）；蜕皮甾酮（成都曼思特生物科技有限公司）；二甲基亚砜(DMSO)(Gibco公司)；脂多糖(LPS)(Sigma公司)；噻唑蓝(MTT)(Amresco公司)；DMEM高糖培养液(Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，北京全式金生物技术有限公司)；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)；ELISA测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2细胞株

小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.3仪器

高压灭菌锅(上海博迅实业有限公司)，722E型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司），细胞超净工作台(Esco　Laminar　Flow　Cabinet公司)，TE2000-5型倒置相差显微镜(Nikon公司)，二氧化碳培养箱(美国　Thermo公司)，酶标仪(PerkinElmer公司)，-80℃低温冰箱(美国Thermo公司)。

2、方法

2..1牛膝水煎液及甾酮类组分的制备

牛膝药材以10倍体积蒸馏水为溶剂，回流提取2次，每次2h，合并提取液过滤，减压回收浓缩得牛膝水煎液提取物。水煎液上D101大孔吸附树脂，以水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，采用紫外分光光度法以蜕皮甾酮为对照品检测可知50%醇洗组分为甾酮类组分，50%醇洗组分减压回收浓缩得甾酮类组分。

2..2细胞培养

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞用含10%胎牛血清、青霉素(1×105　U/L)及链霉素(100　mg/L)的RP-MI1640培养基培养于37℃，5%　CO2的培养箱中培养，隔天传代。

2..3对RAW264.7细胞存活率的影响(MTT法)

取对数生长期的RAW264.7细胞按2×105个/mL稀释为细胞悬液，接种于96孔培养板中，100　μL/孔，在37℃，5%　CO2条件下孵育24h，弃去上清，将含不同药物浓度的细胞培养液100　μL/孔加入细胞培养板中，空白对照组中加入无药物的细胞培养液，每组6复孔，继续孵育24　h后，每孔加入5mg/mL　MTT溶液20　μL继续孵育4　h，弃去上清，每孔加入0.15mL的DMSO充分溶解，使用酶标仪在490nm处测定OD值。计算细胞存活率，以正常对照组细胞存活率为100%，计算各组细胞存活率。细胞存活率=A490(样品组)/A490(空白对照组)×100%。实验结果见表1。

2..4实验分组

实验取对数期生长状态良好的细胞随即分为空白对照组，LPS模型组，牛膝水煎液高、中、低剂量组，甾酮类组分高、中、低剂量组，每个浓度设6个复孔，共8个实验组。

2..5对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响

RAW264.7细胞以2×105/孔接种于96孔板中，置37℃，5%　CO2的培养箱中培养24　h后，弃培养基，分别给以药物及LPS处理，将含不同药物浓度的细胞培养液100　μL/孔加入细胞培养板中，空白对照组中加入无药物的细胞培养液，每组6复孔，继续孵育4　h，加入LPS至终浓度为1　mg/L，继续孵育24　h后，吸取培养液上清0.05　mL至新的96孔板中，加入等体积的Griess试剂A　0.05　mL，室温避光反应5　min；再加入等体积的Griess试剂B　0.05　mL，室温避光反应10　min后，使用酶标仪在540　nm处测定吸光度，计算NO释放量。实验结果见表2。

2..6对LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α，IL-1β的影响

将RAW264.7细胞按2×105个/mL稀释，100　μL/孔接种于96孔细胞培养板中。37℃、5%　CO2培养12　h。弃去上清，将含不同药物浓度的细胞培养液100　μL/孔加入细胞培养板中，空白对照组中加入无药物的细胞培养液，每组6复孔，孵育4　h　，加入LPS至终浓度为1　mg/L，继续孵育24　h后获取细胞上清液3000　r/min离心10　min，吸取上清液按照ELISA试剂盒说明书要求进行操作，于450　nm下读取吸光度值，计算各孔TNF-α，IL-1β的含量。实验结果见表2。

2..7统计学分析

所有实验数据以mean±SD表示，应用SPSS19.0软件进行统计学分析。采用t检验及单因素方差分析ANOVA(one　way　analysis　of　variance)分析方法，以P<0.05作为显著性检验的标准。

3、结果

3.1对RAW264.7细胞存活率的影响

由表1可知，MTT法实验证明牛膝水煎液组、甾酮类组在浓度小于500　μg/mL时均无明显的细胞毒性，对细胞存活率影响在实验允许范围内。故牛膝水煎液高剂量组，甾酮类组分高剂量组选择500　μg/mL为起始质量浓度，倍比稀释。因此选择625　μg/mL（对照组）、500　μg/mL（高剂量组）、250　μg/mL（中剂量组）、125　μg/mL（低剂量组）4个质量浓度进行实验。　

3.2对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响

由表2可知，LPS可诱导RAW264.7细胞释放NO量增加，与空白对照组相比具有极显著差异(P<0.01)；牛膝水煎液高、中、低剂量组，甾酮类组分高、中、低剂量组与模型组（LPS组）相比可显著抑制RAW264.7细胞分泌NO的量(P<0.01)。

3.3对LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α，IL-1β的影响

由表2可知，LPS可诱导RAW264．7细胞释放TNF-α，IL-1β的量增加，模型组（LPS组）与空白对照组相比具有极显著差异(P<0.01)；对于炎症因子TNF-α的释放，牛膝水煎液高、中、低剂量组，甾酮类组分高、中、低剂量组与模型组（LPS组）相比TNF-α水平呈现极显著的抑制效果(P<0.01)；对于炎症因子IL-1β的释放，牛膝水煎液高、中、低剂量组，甾酮类组分高、中、低剂量组与模型组，前文已写出相比IL-1β水平也呈现出极显著的抑制效果(P<0.01)。

4、讨论　

牛膝，味苦、甘、酸，性平。归肝、肾经。用于经闭，痛经，腰膝酸痛，筋骨无力，淋证，水肿等症，其能够减轻淋证的各种症状，对热淋、石淋有很好的疗效，是治疗淋证常用药物。现代医学表明，炎症是许多不同类型疾病的一个共同的病理基础，牛膝入血分，性善下行，通络而直捣血窠，临床用于治疗多种内科疾病，其所治疗的众多疾病都涉及炎症反应，而关于牛膝抗炎作用的研究鲜有报道，故探讨牛膝的抗炎作用、作用机制以及确定其药效物质基础具有重要意义。

巨噬细胞是具有异质性的一类免疫细胞，在体内外不同环境影响下可极化为不同表型参与生理、病理反应，从激活方式上分为经典激活的巨噬细胞和选择性激活的巨噬细胞。LPS是革兰阴性菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物质，作用于受到革兰氏阴性菌感染机体的细胞膜受体，可导致严重炎症感染的发生[9]，其诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7可产生一系列的炎症反应，LPS激活巨噬细胞是一个复杂的信号转导过程，它是介导系统性炎症反应综合症的主要启动因子，引起细胞合成和释放NO等大量的细胞炎症因子，导致强烈的氧化应激反应最终造成细胞的凋亡和坏死[10-11]。NO是一种具有生物活性的气体分子，大量NO的生成与炎症密切相关，在急性炎症部位其会通过细胞毒性效应引起细胞损伤，进而引起炎症相关疾病的发生和发展[12]，IL-1β是介导炎症反应的一种主要促炎因子，TNF-α是一种由多种免疫或非免疫细胞产生的细胞因子,是炎症反应过程中最早和初级内源性介质，具有很强的炎症损伤作用，在机体内是最强炎症介质之一[13-16]。

现采用牛膝水煎液及其甾酮类组分对LPS诱导下RAW264.7细胞影响模型，研究牛膝水煎液及其甾酮类组分的抗炎作用。利用水煎煮及大孔吸附树脂方法的组合应用得到牛膝水煎液及甾酮类组分，结果表明牛膝水煎液及甾酮类组分在浓度小于500mg/L的范围内对RAW264.7细胞无显著毒性，对存活率影响在实验允许范围内。牛膝水煎液和牛膝甾酮类组分高、中、低剂量组与模型组相比可显著抑制RAW264.7细胞NO、TNF-α，IL-1β的分泌量(P<0.01)，故牛膝水煎液和牛膝甾酮类组分能够显著减少RAW264.7细胞NO，TNF-α，IL-1β的释放，具有一定抗炎作用，并呈现出良好的剂量依赖性。因此，牛膝具有抗炎作用，其物质基础为甾酮类成分，其机制可能与抑制活化巨噬细胞炎性因子NO及TNF-α，IL-1β的释放有关，为进一步研究中药牛膝的抗炎作用提供了理论依据。

研究牛膝水煎液及甾酮类组分对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子的影响，探讨牛膝及其甾酮类组分的抗炎作用。方法：体外培养RAW264.7细胞，采用MTT法检测牛膝水煎液及其甾酮类组分对RAW264.7细胞的存活率影响，Griess法测定细胞炎症反应产生的NO含量，ELISA法检测细胞上清液中IL-1β，TNF-α的含量。结果：牛膝水煎液及甾酮类组分能明显抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的分泌（P<0.01），以及IL-1β（P<0.01），TNF-α（P<0.01）的表达，并呈现出良好的剂量依赖性。结论：牛膝水煎液及甾酮类组分在浓度小于500mg/L的范围内对RAW264.7细胞无显著毒性。牛膝水煎液及甾酮类组分可通过抑制细胞NO的分泌与IL-1β和TNF-α的表达而发挥抗炎作用。