鸡马立克氏病琼脂扩散试验方法简介

鸡马立克氏病(MD)是由马立克病疱疹病毒引起的一种传染病，以淋巴细胞增生和肿瘤形成为特征，引起肢（翅）麻痹，以及性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤肿瘤病灶。在鸡的疾病中，马立克氏病是危害最大的疾病之一，鸡群受到感染后，陆续患病，引起大批死亡，常常给养鸡业带来巨大的经济损失。应用琼脂扩散反应检查血清抗体，成为马立克氏病特异性诊断及流行病学调查的一种重要血清学方法。国内外用琼脂扩散试验检疫马立克氏病，实际应用表明该法简便易行，基层兽医单位、鸡场及养鸡专业户均可采用，是一种较为理想的诊断检疫马立克氏病的血清学方法。大家一起来了解一下：

1、试验材料

试验用品：塑料采血管、三棱针、打孔器、滴管、平皿、玻璃棒、烧杯、镊子、剪子、酒精灯和带盖瓷盘、琼脂及含8％氯化钠、pH　7.2～7.4的磷酸盐缓冲液等。

鸡马立克氏病羽囊抗原的制备：将病鸡皮肤呈现红肿感染处的羽毛从贴近皮肤处剪掉，剪下带有羽囊的皮肤，称重，加入二倍量的pH　7.2的磷酸缓冲盐水研磨。-20℃冰结后，再经37℃融化，反复冰融4次。25000　r/min离心15　min，上清液加入0.01％硫柳汞防腐。置低温保存备用，马立克氏病羽囊抗原也可向生物药厂购买。

鸡马立克氏病阳性血清的制备：用已知标准马立克氏病羽囊抗原或通过剖检和组织检查确诊为马立克氏病病鸡群，自病鸡拔下新羽毛若干、剪下羽囊，约5　mm长为抗原。由病鸡群挑选慢性病鸡或康复鸡采取血清。与羽囊抗原作琼脂扩散试验，如出现清晰沉淀线，则为马立克氏病阳性血清，采血分离血清，加0.01％硫柳汞防腐、冰结或4℃保存备用。马立克氏病阳性血清也可向生物药厂购买。

2、操作

琼脂板的制备。用含有8％氯化钠的磷酸缓冲液配制的1％的琼脂溶液加热溶化后倒入平皿中，制成2～3　mm厚的琼脂板，平置室温凝固。

打孔。用打孔器(直径2～3　mm金属小管)按座标纸上面好的七孔图案，照图案固定位置打7个孔，中央打1个孔，孔径为3　mm，外围打6个孔，孔径为2　mm，孔与孔的距离为3～4　mm，如直接以羽囊作试验，则无须打抗原孔。

抗原及血清的添加。用标准抗原检测未知抗体（被检鸡血清）：①用带胶乳头滴管将受检血清顺序逐个滴加于外周2、3、5、6孔内，加入阳性血清于1、4孔内，每加1份受检血清前，必须把吸管充分洗净拭干。②在外围孔滴加受检血清完毕后，用另一滴管向中央孔滴加标准抗原，抗原和血清的加入量以加满不溢出为度。③加样完毕平板加盖，在室温静止片刻，待加样稍吸附下沉后平放在铺有数层湿纱布的带盏瓷盘中，置37℃条件下，进行反应，逐日观察3天，并记录结果。测定抗体效价时，可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血清最大稀释度为抗体效价。

用已知马立克氏病阳性血清检测未知抗原(被检鸡的羽囊）：①羽囊琼脂扩散试验，用镊子镊取羽囊（约5　mm）。尖端向下，插入抗原孔的位置上，一处一根，一只鸡用6根；中央孔滴加已知阳性血清。②孔囊浸液琼脂扩散试验：选拔受检鸡含羽囊丰满的羽毛10根以上，将带有羽髓的毛根剪集于三分管内，每管加入0.5mL磷酸缓冲盐水，用玻璃棒将羽毛根压集于管底，以适当压力转动玻璃棒10多次，待浸提液混浊后，用吸管将其移入外周孔内，一个检样滴一个孔，中央孔滴加已知阳性血清。　

3、判定

阳性：如果受检血清内含有马立克氏病特异抗体或受检羽髓内含有马立克氏病特异抗原，则抗原和抗体孔之间或血清孔与羽囊之间出现一条清晰致密沉淀线，即为阳性，在羽囊琼脂扩散试验中，一只鸡的6根羽囊如有一根出现沉淀线，即判为阳性在羽囊琼脂扩散。阴性：当抗原和抗体孔之间或血清与羽囊之间不形成沉淀线者，则判为阴性。

被检材料可能会出现两条以上的沉淀线，其中一条与已知抗原和阳性血清的沉淀线融合者判定为阳性。当抗原存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度和浓度，比较抗原之间的异同点，因而应用范围比较广。

4、注意事项

对剪集的雏鸡羽髓根或羽髓含量较少的羽根，需加少量磷酸缓冲盐水浸提。水量不宜过多，以防由于稀释而影响反应结果。

在滴加已知材料或未知材料时，注意不要产生气泡，均以加至平满为宜；过少则降低反应效果；过多则易出现加样连片。

反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致出现假阴性，甚至不出现或不清楚。琼脂板孔打毕后，将琼脂板底面在酒精灯上稍微加热封底。

在处理和滴加每份受检样品前，必须将玻璃棒和滴管彻底冲洗拭干。每次加完不同样品后要更换枪头，以免造成污染。处理或使用过的受校样品可放在普通冰箱内，以备必要时复检用，待判定结果无误时废弃。马立克氏病抗原和血清等诊断试剂需低温保存，以防降低效价。